为什么联川单细胞数据质量那么高？答案在这里 | 单细胞专题

为了保证单细胞数据的质量，以及保证数据与真实情况相匹配，避免人为引入的偏差，单细胞样本（无论是新鲜解离样本还是冻存的抽核样本）在上机前都会经历严格的指控。但在很多情况下，由于样本或细胞特性，即使在已经对样本采取了多种优化措施的情况下，还是会存在样本质量不达标而不满足上机的情况，或者虽然样本质量并合格上机后，但数据分析却出现了细胞鉴定困难，实际分析结果和预期猜想或者文献报道极度不符的情况。在这个时候寻找一种强有力的高效的优化珍贵样本的上机质量方法便迫在眉睫。

流式细胞术是一种可对溶液中的单个细胞进行快速筛选和分析的技术。流式细胞仪利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，这些信号由光电二极管或光电倍增管等检测器读取。这些信号被转换成电子信号，标准化格式 (.fcs) 数据文件输出。特定的细胞亚群可以基于它们的荧光或光散射特性进行分析并进行分离纯化。在单细胞测序中，为了达到特定的目的，需要对特定的细胞进行富集，在活率较低的样本进行去死，对抽核样本进行背景RNA和碎片的去除，那流式细胞仪是否也能通过有效分离目的细胞或细胞核来优化样本质量呢？答案是肯定的。详见：

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01解决背景脏的问题

单细胞样本制备过程中由于组织在解离过程中细胞较为脆弱或者解离酶对细胞损伤较大，导致大量细胞破裂，细胞内的RNA或者细胞碎片释放至环境中，在10x上机过程中被包进了油包水结构中，当作细胞自身的RNA计入了后续的数据分析中（图1）。当我们把解离样本通过流式细胞仪后，通过细胞粒径大小（FSC）和内容物的复杂度（SSC），把细胞区分并筛选出来（图2），这样很好改善了ambient RNA和细胞碎片的影响，提高单细胞数据质量。

图1 ambient RNA影响的示意图

图2 流式分选FSC-SSC示意图

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02解决活率低的问题

此外，单细胞测序对于细胞活率要求较高，而对于实体组织来说，细胞间基质一方面保护着细胞，另外一方面也阻碍着消化酶发挥作用解离成单细胞。因此，在这个过程中需要用到大量的机械方法或者效价更高的酶来进行消解。这个过程中可能会让细胞受伤并让细胞活力下降。细胞开始死亡有以下几个表现：

1）细胞膜上的磷脂酰丝氨酸在早期凋亡的时候会从内膜外翻至外膜；

2）细胞膜开始变得不完整，开始破碎。

在这个时候Annxin-V就能和磷脂酰丝氨酸结合，PI/7-AAD就能因为细胞膜通透性上升而进入细胞核。根据这个原理，我们可以用Annexin-V/7-AAD双染的方法通过流式细胞仪，将Annexin-V-7-AAD-的细胞筛选出来我们就能将死亡或者状态不好的细胞给剔除（如图3）。当然，Annexin-V在和磷脂酰丝氨酸结合的时候需要高钙的环境，那么高钙环境是否会改变细胞原有的细胞内基因表达模式呢？原则上短时间内的影响是不大的，但如果担心影响结果的话，可以采用PI或者7-AAD单染的形式进行。通过将PI/7-AAD阳性的细胞剔除后剩下来那些没被燃料染上的即为细胞膜完整的，活性较高的细胞。

图3 活细胞/凋亡细胞分选

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03对抽核实验的优化

流式细胞术在单细胞数据优化方面最大的也是最直接的帮助是在抽核实验上。对于抽核的样本来说，常会碰到一些解离后破碎的大的细胞器（例如：线粒体），这种大的半自主细胞器，无法通过离心的方法与细胞核进行区分。此外，对于抽核样本来说，由于细胞核具有大量的DNA和RNA，并且在特殊的离心和高钙环境的解离条件下，极容易造成细胞核之间的抱团和黏连体，并且通过离心等条件也是很难把条件给优化的。

流式细胞仪的FSC和SSC能够表征粒径的大小和内容物的复杂度。因此通过流式在一定程度上，能够将小的碎片以及背景RNA给过滤掉（图2）。但对于大小和细胞核相近的颗粒来说，仅仅通过FSC和SSC不能完全区分。那么对于这种情况下，如何通过改善方法来优化单细胞数据呢？对于半自主的细胞器来说，其DNA含量会显著低于细胞核，也就是说我们可以通过DNA的含量来进行区分。PI或者7-AAD能对DNA进行染色，通过流式细胞仪检测PI或者7-AAD发出来的荧光强度区分细胞核和其他大体积的细胞器（图4）。

如图4中的P3门所示（蓝色），该抽核样本在上机前经过了多次的离心和重悬，并通过粒径和内容物的复杂程度把碎片给剔除掉，但当我们把它通过流式细胞仪来进行表征的时候能够发现，离心和重悬方法并不能非常有效的去除大碎片或者大细胞器，还是会有很多物质和细胞核混在了一起，如果不经过流式分选，那么对于抽核样本来说会降低测序数据的使用量并导致整体的测序质量下降。

因此对于抽核样本来说，过流式是非常必要的。对于常规的不过流式的抽核数据，当中混杂着大量的背景RNA，在后期细胞鉴定和差异分析存在大量的数据不准或者失真的情况，而经过流式在上机的样本能显著降低背景，用最真实的方法保证了数据的可用性和准确性。

图4 染色分选示意图

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04解决稀有细胞难捕获的问题

在单细胞平台有限的捕获效率下，一般单个样本会建议捕获2000~20000个高质量细胞，因此当想要研究的目的细胞占比特别低的情况下，在有限的捕获细胞里面，实际能拿到的目标细胞可能所占无几，这个时候就无法对目标细胞进一步深入研究。那么如何解决这个问题呢？

一般会选择对目标细胞先进行富集，然后再进行单细胞捕获，以拿到更多的目标细胞。通过抗体对所需要的细胞进行染色，并通过流式细胞仪进行富集，使得那些占比低的细胞得到积累，然后被单细胞系统捕获。举个例子，MAIT在全血中比例低，但目前MAIT细胞的研究趋势越来越热，那么如何进行富集呢？直接对MAIT细胞进行收集需要用到大量抗体和大量的圈门和分析，但MAIT在CTL中，MAIT比例高达10%。所以，在这个时候，我们可以直接把CTL细胞拎出来进行上机，这样，MAIT细胞预计能达到总的捕获细胞的10%左右，这样就有足够的细胞满足进行深入分析。

图5 流式细胞仪流抗的原理

图6 淋巴细胞的分选

总结来说，流式细胞术在单细胞领域的应用前景非常广泛，流式细胞术能解决单细胞实验中样本制备存在的问题，去除细胞悬液碎片、ambient RNA，提升细胞活性，纯化细胞核悬液，以及富集稀有细胞等，为单细胞实验保驾护航，推动单细胞研究进入“高清”时代！

参考文献

Reichard A, et al. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 2019 Feb;95(2):219-226.

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关于联川生物

杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组及最新的单细胞测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近50篇，影响因子平均15+。

 
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